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?中瑞祥解析活性氧在線分析儀操作步驟注意事項

主要通過熒光探針檢測原理工作，利用DCFH-DA等探針與細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）反應(yīng)生成熒光物質(zhì)，通過熒光強(qiáng)度定量ROS水平?。以下是具體原理和操作步驟：

檢測原理

?熒光探針法?：DCFH-DA探針無熒光，可穿透細(xì)胞膜，在細(xì)胞內(nèi)被酯酶轉(zhuǎn)化為DCFH。DCFH被ROS氧化后生成強(qiáng)熒光的DCF，熒光強(qiáng)度與ROS濃度成正比。 ?

?其他方法?：還包括化學(xué)發(fā)光法、電子順磁共振（EPR）等，但熒光法因靈敏度高、操作簡便應(yīng)用。 ?

操作步驟

?細(xì)胞準(zhǔn)備?

貼壁細(xì)胞：檢測前1天鋪板，密度<5×10?/mL。

懸浮細(xì)胞：收集后調(diào)整密度至1.0×10?-2.0×10?。 ?

?藥物誘導(dǎo)（可選）?

用無血清培養(yǎng)基稀釋藥物處理細(xì)胞，孵育時間因藥物和細(xì)胞類型而異（如HeLa細(xì)胞需30-60分鐘）。 ?

?陽性對照（可選）?

用Rosup（100 μM）處理細(xì)胞，提高ROS水平，驗證檢測效果。 ?

?探針裝載?

DCFH-DA稀釋至10 μM，避光孵育30分鐘。

洗滌去除未進(jìn)入細(xì)胞的探針。 ?

?檢測方法?

?熒光顯微鏡?：FITC濾光片觀察熒光，懸浮細(xì)胞需滴加至載玻片。 ?

?流式細(xì)胞儀?：488 nm激發(fā)，530 nm發(fā)射，分選ROS陰性/陽性細(xì)胞。 ?

注意事項

避光操作：DCFH-DA對光敏感，需全程避光。

細(xì)胞狀態(tài)：確保檢測時細(xì)胞活性良好，避免非特異性熒光干擾